一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒

保存條件：

-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。如果經常使用，FITC-dUTP和5×ReactionBuffer可放2-8℃保存。

產品簡介：

一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細胞凋亡早期檢測方法。對于經過固定和洗滌的細胞或組織，只要經過一步染色反應，洗滌后就可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測到凋亡細胞。

細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。基因組DNA斷裂時，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL(TdT--mediateddUTPNick-EndLabeling)法檢測細胞凋亡的原理。

操作步驟

1.a.對于細胞片或者冰凍切片,常規固定,PBS或HBSS洗滌3次（可選步驟：用含0.1％ Triton X-100的PBS孵育2分鐘。）。
b.對于石蠟切片,常規脫蠟透水,滴加20μg/ml蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的*作用溫度和時間需自行摸索)。PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。

2．配制TUNEL檢測液：按比例,每個樣品,取10ul 5×Reaction Buffer,加入38ul ddH2O，加入1ul FITC-dUTP,加入1ul TdT酶,混勻。（如果zui后背景較深，可適當減少FITC-dUTP和TdT酶）

3．在樣品上加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育30-60分鐘。配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。注意：孵育時需注意保濕,盡可能的在濕盒中孵育,以減少TUNEL檢測液的蒸發，如果標本較小，可適當的減少試劑的用量。

4．PBS或HBSS洗滌2次。

5．用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。

6．對于懸浮細胞或細胞懸液：可以收集不超過10⁶個細胞，同樣固定，清洗，染色，清洗，zui后用250-500μlPBS或HBSS懸浮，流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

常見問題:

1．出現非特異性熒光標記。
a．有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b．使用了不適當的固定液，例如一些酸性固定液，導致出現假陽性。建議采用推薦的固定液。

c．TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。

2．熒光背景很高。
a．支原體污染。
b．高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現細胞核中的DNA斷裂。
c．TUNEL反應過強。減少酶和FITC-dUTP的加入量。
d．紅細胞中血紅蛋白導致的自發熒光產生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。

3．標記效率低。
a．使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b．固定時間過長，導致交聯程度過高。此時宜減少固定時間。

c．在加標記液衣，可以用含0.1％ Triton X-100的PBS重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。
d．熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
e．碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發產生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。