SYBR Green II(10000×)

SYBR Green II RNA染料是一種高敏感的核酸染色試劑，可以對(duì)RNA或者是單鏈的DNA進(jìn)行染色。使用300nm透射光顯影的情況下，非變性凝膠中檢測(cè)核酸的靈敏度可以達(dá)到5×10-7克。與傳統(tǒng)的EB染料相比SYBR Green II RNA染料的靈敏度更高，可以應(yīng)用于雜交前RNA質(zhì)量的檢測(cè)，同時(shí)不會(huì)影響后續(xù)的轉(zhuǎn)膜，還可應(yīng)用于變形梯度凝膠電泳（DGGE）和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）等實(shí)驗(yàn)。SYBR Green II RNA染料可以代替銀染和EB染色，消除了銀染復(fù)雜、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)；與EB染色相比，形成的SRBR Green II -RNA復(fù)合物所激發(fā)的熒光是EB-RNA復(fù)合物激發(fā)熒光的7倍。SYBR Green II RNA染料并不是特異性的結(jié)合RNA或者DNA單鏈，但是其對(duì)單鏈的結(jié)合效率是雙鏈的約2倍，廣泛的應(yīng)用于RNA的質(zhì)量分析中。

染色方法：

SYBR Green II RNA 染料檢測(cè)核酸時(shí)即可預(yù)染也可以電泳后再進(jìn)行染色。做預(yù)染使用時(shí)，取1ul貯存液加入1ml TE緩沖液或者滅菌雙蒸水中混勻，再加入1ml 的6-loading buffer上樣緩沖液混勻（此時(shí)溶液為1：2000稀釋?zhuān)礊楣ぷ饕海╇娪緯r(shí)取1-2ul工作液和5ul電泳樣品混勻后直接上樣。注意：須將商品化的核酸MARKER作一定倍數(shù)的稀釋?zhuān)?/5-1/10），這樣才能得到比較理想的結(jié)果。

電泳后染色。電泳后，在室溫、避光的情況之下準(zhǔn)備染色液。染色液要在塑料器皿中制備而不要在玻璃器皿中，因?yàn)椴ＡП韺訉?duì)該試劑有吸附作用。

染料取出后室溫放置，恢復(fù)室溫后簡(jiǎn)單離心混勻。

染色液使用1×TBE緩沖液進(jìn)行1：10，000稀釋。如果是瓊脂糖甲醛變性膠，用1×TBE做1：5，000的稀釋。由于SYBR Green II RNA染色液靈敏度高，所以要選用新鮮的1×TBE緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)悦饩彌_液中殘存的雜質(zhì)產(chǎn)生背景，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。注意：為了提高染色的靈敏度，要確定緩沖液的PH值在7.5和8之間，因?yàn)镾YBR Green II RNA染色液對(duì)PH敏感。

把膠放在塑料的染色容器中，加入足夠染色液使之覆蓋整塊膠。用鋁箔遮蓋或者是放在暗處避光。在染色之前沒(méi)有必要先將膠中的變性劑如尿素和甲醛洗出來(lái)，因?yàn)镾YBR Green II RNA染色液復(fù)合物發(fā)出的熒光在甲醛或者尿素存在時(shí)不會(huì)猝滅。

在室溫下輕輕搖晃凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的*染色時(shí)間是10-40分鐘，瓊脂糖凝膠的*染色時(shí)間是20-40分鐘。染色時(shí)間也可能隨著凝膠的厚度和濃度變化。由于其熒光本底很低，凝膠染色后無(wú)需脫色。染色工作放在2-8°C避光保存，可以重復(fù)使用3-4次。注意：SYBR Green II RNA染色液不影響RNA向膜上的轉(zhuǎn)移和northern中的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

染色膠顯色和成像：SYBR Green II RNA染色液復(fù)合物所激發(fā)的熒光可以使用300nm和254nm光波照射，通過(guò)Wratten 15 濾光片檢測(cè)。注意：由于熒光本底較低，所以可以通過(guò)適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間的方法檢測(cè)痕量的核酸。

請(qǐng)帶手套操作。

貯存

SYBR Green II RNA染色液保存于DMSO溶液中，此貯存液于保存溫度為-20°C，放置于避光干燥器中，在以上條件下，可在保存一年。稀釋工作液在2-8°C可以放置一周，在室溫放置3-4天。